La Sacristía es una nave de planta rectangular dividida en cinco bóvedas de medio punto, cuyos arcos apean sobre pilastras de orden toscano. Está decorada con pinturas barrocas en muros y bóvedas. Todo el decorado de esta sala, fue pintado al temple por Manuel Ruiz y Fr. Juan de la Peña. En los cinco tramos de la bóveda de cañon, cinco cuadros evocan escenas de la vida de San Jerónimo. Sobre los arcos interiores de las dos portadas, campean los escudos del santuario y de la Orden Jerónima. La ornamentación general muestra guirnaldas de flores, frutas de suaves tintas, motivos de fauna, rostros humanos, ángeles, hipógrifos, recuadros, cartelas y otras figuras, pintadas en suaves y vivos colores.
    Recorre la sala un zócalo de jaspe gris azulado, sencillo y elegante.
    En perfecta sintonía con el decorado se encuentra el mobiliario, destacando, por su sencillez y hermosura, unas cajoneras de granadillo y nogal, situadas dentro de los huecos que hay debajo de las cornisas del basamento.
La estancia tiene aires de suntuosa pinacoteca con los lienzos de Francisco de Zurbarán que la llenan de luz y color.
La sacristía de Guadalupe, merece la pena visitarse por la extrordinaria colección de cuadros de Zurbarán que en ella existen, así como sus decorados y el resto de conjunto arquitectónico que forman un conjunto bellísimo por el cual ha merecido el sobrenombre de "Capilla Sixtina extremeña".

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